Beer-Lambert Yasası ile Konsantrasyon Hesaplama ve Küvet Seçimi
Bu bilgilendirme yazısıdır. Model, ölçü ve fiyat bilgileri için spektrofotometre sayfamızı inceleyin.
Spektrofotometre ile yapılan ölçümlerin büyük kısmı, ölçülen absorbans değerinden maddenin konsantrasyonunu bulmaya dayanır. Bunun temeli Beer-Lambert yasasıdır. Doğru sonuç için yasanın sınırlarını bilmek ve uygun küveti seçmek gerekir.
Beer-Lambert yasası
A = ε · b · c
- A: Absorbans (birimsiz)
- ε: Molar soğurma katsayısı (L·mol-1·cm-1)
- b: Işık yolu uzunluğu, standart küvette 1 cm
- c: Konsantrasyon (mol/L)
Örnek hesap
ε değeri 15.000 L·mol-1·cm-1 olan bir madde, 1 cm küvette 0,450 absorbans veriyorsa: c = A / (ε · b) = 0,450 / 15.000 = 3,0 × 10-5 mol/L.
Kalibrasyon eğrisi hazırlamak
- Beklenen numune konsantrasyonunu kapsayan en az 5 standart çözelti hazırlayın.
- Kör (blank) çözeltiyle cihazı sıfırlayın.
- Standartları düşükten yükseğe doğru ölçün.
- Absorbans–konsantrasyon grafiğini çizin; doğrusallık için R² değerinin 0,995 ve üzerinde olması beklenir.
- Numunenin absorbansını ölçüp doğru denkleminden konsantrasyonu hesaplayın.
Yasanın geçerli olmadığı durumlar
- Çok yüksek absorbans (genellikle 1,5–2'nin üstü): Numuneyi seyreltin; en güvenilir aralık yaklaşık 0,1–1,0'dır.
- Bulanık veya ışığı saçan numuneler: Filtreleyin veya santrifüjleyin.
- Kimyasal denge değişimi: pH veya sıcaklık değişince soğurma da değişebilir.
Doğru küvet seçimi
| Küvet | Kullanılabilir bölge | Not |
|---|---|---|
| Plastik (PS / PMMA) | Görünür bölge | Tek kullanımlık, ekonomik |
| Optik cam | Görünür bölge | Yıkanıp tekrar kullanılabilir |
| Kuvars | UV ve görünür bölge | 260/280 nm DNA–protein ölçümleri gibi UV analizlerinde zorunlu |
Küvet kullanım ipuçları
- Küveti yalnızca buzlu (mat) yüzlerinden tutun.
- Ölçümden önce küveti numuneyle 2–3 kez çalkalayın.
- Kuvars küvetleri fırça ile değil, uygun çözeltiyle temizleyin; çizik ışık saçar.
- Küveti her ölçümde aynı yönde yerleştirin.
Dalga boyu seçimi
Ölçüm, maddenin en fazla ışık soğurduğu dalga boyunda (λmax) yapılır. Bu noktada hem hassasiyet en yüksektir hem de dalga boyundaki küçük sapmaların sonuca etkisi en azdır. λmax, maddenin bir standart çözeltisiyle tarama (spektrum) alınarak bulunur.
Sık sorulan sorular
Kör (blank) çözelti nedir?
Numunenin içinde ölçülen madde dışındaki her şeyi (çözücü, reaktifler) içeren çözeltidir. Cihaz bununla sıfırlanır; böylece yalnızca ölçülen maddenin soğurması kalır.
Absorbans ile geçirgenlik (%T) arasındaki ilişki nedir?
A = −log(T). Örneğin %10 geçirgenlik 1,0 absorbansa, %1 geçirgenlik 2,0 absorbansa karşılık gelir.
1 cm'den farklı küvet kullanırsam ne olur?
Absorbans ışık yolu ile doğru orantılıdır. 0,5 cm küvette aynı numune yaklaşık yarı absorbans verir; hesapta b değerini buna göre kullanın.